關(guān)于明膠酶譜法試劑盒脫色液配方的注意事項(xiàng)！

本公司銷售的基質(zhì)金屬蛋白酶MMP2/MMP9明膠酶譜試劑盒，其中脫色液配方：冰醋酸:甲醇:水＝7:5:88（V:V:V），很多老師不明年這里面的冰醋酸是什么，我們今天給大家講解一下。

這個(gè)冰醋酸不是醋酸也不是乙酸，冰醋酸也叫冰乙酸，就是純的無(wú)水乙酸。不過(guò)我們選擇常規(guī)的98%乙酸也是可以的。

檢測(cè)步驟：

1. 制備含 MMP 底物蛋白的 SDS-PAGE 凝膠：推薦分離膠濃度為 8%。按照標(biāo)準(zhǔn)程序制備 SDS- PAGE 凝膠。將 10 × substrate G 融化，并 90 ºC 加熱 5 分鐘。分別在濃縮膠和分離膠中額外加 入 10 × substrate G 并使之稀釋 10 倍，混勻后加入過(guò)硫酸銨和 TEMED，等待凝膠聚合。

2. 待測(cè)樣品 1:1 稀釋于 2 × SDS-PAGE non-reducing buffer (用完后可自行配制：4% SDS, 100 mM Tris-Cl pH6.8, 20% glycerol, 0.02% bromophnol blue)，混合后直接上樣。切勿加熱變性，并且僅 使用不加還原劑的上樣緩沖液。可通過(guò)預(yù)試驗(yàn)確定加樣量，使用普通蛋白預(yù)染  Marker 即可。陽(yáng) 性對(duì)照(可選步驟)：可取人、小鼠、大鼠或兔 100µl 全血與 100µl 2 × SDS-PAGE non-

reducing buffer 等體積混合，取 5-15µl 上樣。

3. 低電流恒流電泳，每一塊小膠電流為 20mA/gel。溴酚藍(lán)跑出凝膠前沿時(shí)結(jié)束電泳。

4. 洗滌凝膠：取出凝膠，去除濃縮膠，放入容器內(nèi).可先用適量蒸餾水沖洗凝膠，然后加入10ml

1× Buffer A(用蒸餾水稀釋)，室溫漂洗凝膠 2 × 30 分鐘。中間換液。

5.  孵育：倒掉 Buffer A。加入 10 ml 1× Buffer B(蒸餾水稀釋)，室溫或 37ºC 孵育 1~5 小時(shí)。陽(yáng)性 對(duì) 照或者血中的 MMP 通常 37ºC 孵育 1 小時(shí)即可顯示。如 MMP 活性低，應(yīng)延長(zhǎng)孵育時(shí)間為 10 小時(shí)或 過(guò)一夜。

6.  顯色：倒掉 Buffer B，加入 SDS-PAGE 凝膠蛋白質(zhì)考馬斯亮藍(lán)染色液（操作步驟見(jiàn) SDS-PAGE 凝 膠蛋白質(zhì)考馬斯亮藍(lán)染色液說(shuō)明書）。凝膠的大部分區(qū)域被深染，在有 MMP 條帶的位置 不被染 色而形成透亮區(qū)域。透明區(qū)域的位置和范圍指示 MMP-2、MMP-9 的大小位置(酶譜)及 活性。陽(yáng) 性對(duì)照將在 66~72 (MMP-2)、92 (MMP-9)、130 (proMMP-9)、225 (proMMP-9) kDa 位置出現(xiàn)透明條帶。

7. 條帶掃描：將凝膠放在掃描儀上掃描。雖然 MMP 條帶透明，但凝膠背景并非真正全黑。解決 辦法：可用非透射光掃描，或用軟件圖像處理程序調(diào)整背景顯示為灰度顯示，并盡量設(shè)置為黑色.MMP條帶則為白色，這種背景黑條帶白的格式是英文論文中zui常見(jiàn)的格式。

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