RNA結(jié)合蛋白免疫沉淀技術(shù)又稱為RIP（RNA immunoprecipitation），可以說是RNA版的ChIP（染色質(zhì)免疫沉淀），該技術(shù)能幫助人們分析與RNA結(jié)合蛋白相關(guān)的核酸。

在RIP試劑盒（如Sigma的Imprint® RNA Immunoprecipitation kit）的幫助下，研究者們能夠利用針對RNA結(jié)合蛋白的抗體，從細(xì)胞提取物中捕獲與蛋白相結(jié)合的RNA，再通過qPCR、芯片或二代測序技術(shù)對這些RNA進(jìn)行鑒定。

不論是細(xì)胞質(zhì)還是細(xì)胞核，都會發(fā)生RNA與蛋白的相互作用。據(jù)Active Motif公司產(chǎn)品Kyle Hondorp介紹，該公司的RNA ChIP-IT® kit于研究RNA與細(xì)胞核染色質(zhì)的相互作用。該試劑盒通過甲醛固定來鎖定RNA-染色質(zhì)的互作，隨后對染色質(zhì)進(jìn)行超聲，并用DNAse I處理，zui后利用磁珠進(jìn)行沉淀。

“如你研究的是總mRNA，那么常規(guī)RIP試劑盒更合適一些，”Hondorp說，“常規(guī)RIP試劑盒可以處理所有細(xì)胞裂解物的總mRNA。”

生物試劑Magna RIP™ RNA-binding protein immunoprecipitation kit的EMD Millipore公司，也在開發(fā)專門針對染色質(zhì)的RIP試劑盒。預(yù)計(jì)這一新產(chǎn)品將于2014年*季度發(fā)布，該產(chǎn)品有化學(xué)交聯(lián)與native兩種形式。據(jù)介紹，化學(xué)交聯(lián)可以分析究間接的蛋白-RNA相互作用，研究更高分子量的蛋白復(fù)合物。而native方法展現(xiàn)的是，親和力更高也更為直接的相互作用。

除RIP以外，CLIP（UV crosslinking and immunoprecipitation）也可以幫助人們捕捉與RNA結(jié)合蛋白互作的核酸。CLIP方案整合了交聯(lián)與核酸酶消化，不僅允許對RNA-蛋白復(fù)合物進(jìn)行進(jìn)一步的純化（如凝膠電泳片段分離），還能夠揭示RNA-蛋白互作所發(fā)生的位點(diǎn)。zui近人們又開發(fā)出了新型CLIP 技術(shù)——iCLIP（individual-nucleotide resolution CLIP），該技術(shù)能夠以單個(gè)堿基的分辨率，來展示RNA-蛋白互作的詳細(xì)信息。

據(jù)倫敦大學(xué)學(xué)院的Jernej Ule教授介紹，CLIP與RIP的關(guān)鍵性差異，在于沉淀復(fù)合物后的凝膠純化步驟。CLIP技術(shù)可以給RNA-蛋白復(fù)合物的RNA末端帶上放射性標(biāo)記，并將這些復(fù)合物進(jìn)行SDS-PAGE分離，之后轉(zhuǎn)移到一張膜上。這樣的過程可以提高純化的特異性，減少非特異性的RNA。蛋白酶消化可以將RNA從膜上解離下來，用于制備cDNA文庫，以備測序分析。

“CLIP要比RIP麻煩一些，不過我認(rèn)為它很值得采用，”Ule說。“放射性信號的量及其特異性，能夠幫助我們提高cDNA文庫的質(zhì)量，zui終得到準(zhǔn)確實(shí)用的數(shù)據(jù)。”

ChIRP、CHART和RAP

如果你對某種RNA感興趣，希望研究與其發(fā)生相互作用的蛋白，就需要采用新的實(shí)驗(yàn)方案。ChIRP（chromatin isolation by RNA purification）、CHART（capture hybridization analysis of RNA targets）和RAP（RNA antisense purification）都基于同樣的理念，將與目標(biāo)RNA互補(bǔ)的寡核苷酸進(jìn)行生物素標(biāo)記，并由此捕獲相關(guān)蛋白。之后研究者可以通過二代測序或質(zhì)譜分析，來鑒定與RNA互作的蛋白，明確發(fā)生這些互作的基因組區(qū)域。

據(jù)NEB的G. Brett Robb介紹，上述三種方法解決了當(dāng)今RNA生物學(xué)中的關(guān)鍵需求。目前，研究者們已經(jīng)鑒定了大量的lncRNA，但卻不清楚它們的功能。“解決這一問題的途徑之一，就是尋找與這些RNA發(fā)生互作的蛋白。”舉例來說，加州理工學(xué)院的Mitchell Guttman和賓州大學(xué)的Jeannie Lee，就分別在使用RAP和CHART對Xist lncRNA展開研究。

據(jù)悉，目前ChIRP、CHART和RAP技術(shù)都還沒有商業(yè)化。不過有一個(gè)試劑盒可以實(shí)現(xiàn)從已知RNA分離蛋白，即MBL International的RiboTrap系統(tǒng)，該系統(tǒng)能夠利用體外轉(zhuǎn)錄的RNA（帶生物素標(biāo)記），從細(xì)胞提取物中分離與之結(jié)合的蛋白。

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